欧洲分子生物学实验室研究人员Moritz Kueblbeck•○•, Andrea Callegari等在bioRxiv分享了一项基于CRISPR方法优化的技术文章，目的在于提升从基因编辑产生的细胞中筛选纯合子的效率★-△。众所周知▪，使用CRISPR精确敲入 (knock-in) 外源性DNA后，产生的基因编辑克隆需要严格的筛选才能得到目的克隆（纯合子）。基于常规PCR和Southern Blot检测目的克隆的方法耗时长、需要大量劳动力。因此研究人员对传统方法进行了优化，采用荧光标记蛋白和naica数字PCR联合的方法，精准快速的实现了基因编辑后目的克隆的筛选，大大降低了检测的人力、物力、时间成本。

　　亮点：☑  采用数字PCR和荧光标记的方法，可以在基因组编辑的早期阶段进行检测，整个流程只需要大约3-4小时即可获得结果，能够及时停止…▪“不理想☆”的编辑克隆的培养，节省人力物力成本。

　　☑  数字PCR方法只需要检测少量的细胞，相较于Southern Blot大大减少样本制备时间▪□◁。

　　微滴芯片数字PCR系统的多重检测能力和Crystal Miner软件的荧光补偿校正功能，能够快速▷▪、可靠的对CRISPR编辑细胞进行定量筛选检测。

　　背景原理介绍：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），规律间隔成簇短回文重复序列，是一种RNA引导的基因组编辑技术□•-,能对基因进行精确性敲除▽▼,敲入,替换等,从而实现探究基因功能,修复致病基因等目的。但是，CRISPR技术也会导致有潜在危险的“脱靶”问题•，带来不可预测的基因变化，因此对于CRISPR基因编辑的脱靶情况需要灵敏且精准的验证及检测•…▼。

　　传统方法筛选目的克隆的局限性：基因编辑后○▽▲，筛选纯合子的方法是生成杂合克隆后，通过轮次迭代产生纯合子，整个过程耗时甚至能长达一年，且容易发生脱靶修饰。使用常规PCR区分纯合克隆和杂合克隆的方法只能检测到目的基因，还需要金标准Southern Blot检测脱靶整合的情况，然而，Southern Blot是一种耗时且低通量的技术，需要相对大量的基因组DNA和细胞材料，这些材料的制备会浪费大量的时间和人力成本。

　　优化后的新方法：针对上述问题，Moritz Kueblbeck等人优化了CRISPR的实验流程▷，改进了CRISPR的转染效率，通过添加荧光标签蛋白实现CRISPR编辑的克隆菌落中相关标记蛋白的正确亚细胞定位-◇，并通过dPCR 来定量目的基因和脱靶基因组编辑事件。通过该方法▪◆★，快速、可靠的对荧光标记CRISPR编辑细胞进行了定量筛选■■☆。【见下图】

　　▲Moritz Kueblbeck等人优化的CRISPR纯合子筛选实验流程

　　▲PCR进行两种细胞系中的标签基因检测。U2OS- TPR-SNAP标签基因整合总数检测 （左）；

　　HK- Nup93-mEGFP标签基因整合总数及目的标签基因检测（右）。矩形图代表克隆，每个红点代表一次测量结果▼●▷。

　　对于多重荧光检测实验，进行荧光溢出的补偿校正是十分必要的。本研究使用naica

　　微滴芯片数字PCR系统进行多重检测，并使用Crystal Miner软件进行荧光补偿校正分析…•，确保每一个荧光基团被单一检测通道捕获，得到的结果精准可靠。如想对荧光补偿校正有更多了解，请复制下方链接地址到浏览器进行查看▪○★：

　　微滴芯片数字PCR技术在进行核酸检测时具有独特的优势▼。系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的唯一耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器•□•，整个流程只需要两个半小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析◁，获得的数据真实可靠。

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